一种新型活组织材料的组织学及力学特性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.34.008

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (34): 6110-6115.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.34.008

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一种新型活组织材料的组织学及力学特性

陈晓松¹，张建²，李建新²

首都医科大学宣武医院，¹泌尿外科，²血管外科，北京市 100053

出版日期:2013-08-20 发布日期:2013-08-20
通讯作者: 张建，教授，博士生导师，主任医师，首都医科大学宣武医院血管外科，北京市 100053
作者简介:陈晓松，男．1975年生，河北省香河县人，汉族，2007年首都医科大学毕业，博士，主治医师，主要从事修复医学、组织工程、泌尿外科学基础与临床方面的研究。 cxsyzhjdsh@sina.com
基金资助:
国家“八六三”重大专项(2006AA02A134)；
北京市科委重大项目(H020920040330)。

Histological and mechanical properties of a new-type biopsy material

Chen Xiao-song¹, Zhang Jian², Li Jian-xin²

¹Department of Urology, ²Department of Vascular Surgery, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, Beijing 100053, China

Online:2013-08-20 Published:2013-08-20
Contact: Zhang Jian, Professor, Doctoral supervisor, Chief physician, Department of Vascular Surgery, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, Beijing 100053, China
About author:Chen Xiao-song, M.D., Attending physician, Department of Urology, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, Beijing 100053, China cxsyzhjdsh@sina.com
Supported by:
the National High-Tech Research and Development Program of China (863 Program), No. 2006AA02A134*;
Beijing Scientific Committee Key Project, No. H020920040330*

摘要/Abstract

摘要：

背景：异物诱发包裹产生的包裹组织是一种自体活组织材料，理论上完全避免了非自体植入物所面临的免疫排斥反应和破坏作用，具有合成材料及脱细胞所无法比拟的生物学优势。

目的：试图开发出一种只含有自体细胞和细胞外基质成分的自体活组织生物材料，并评价其组织结构及力学特征。

方法：将硅胶管植入犬腹腔1个月，获得包裹形成的荚囊样生物组织，然后经过体外修整形成管型结构即自体活组织生物管。对标本进行了力学测定、组织学观察及表面结构分析。

结果与结论：腹腔内植入硅胶管形成的自体活组织生物管取材方便，主要由富含Ⅰ型和Ⅲ型胶原的细胞外基质构成，成肌纤维细胞排列在胶原纤维间，呈同心圆样结构，培养1个月时，管壁厚度可达70-250 μm，可耐受(1 100±187) mm Hg (1 mm Hg=0.133 kPa)的静水压，具有很好的可缝合性。提示自体活组织生物管形态可塑性大，由自体细胞及细胞外基质成分构成，避免了免疫排斥反应的发生，且具有足够的力学强度，有希望用于组织工程化血管的体外构建。

关键词: 生物材料, 材料生物相容性, 组织工程血管, 自体移植, 生物管, 自体活组织材料, 断裂拉伸强度, 断裂伸长率, 爆破强度, 可缝合性, 863项目

Abstract:

BACKGROUND: The biopsy material induced by foreign body is autologous tissue, which, in theory, avoids the role of immune rejection and destruction faced by non-autologous implants. This biology advantage has no way to comparison by synthetic and de-cellular materials.

OBJECTIVE: To explore a biotube consisting of autologous cells and extracellular matrix and to evaluate its structure and mechanical features.

METHODS: The biotubes were prepared by embedding silicon rods as a mold intraperitoneally. Specimens were analyzed by mechanical tests, histological observation and superficial study.

RESULTS AND CONCLUSION: It was easy to excite the biotubes prepared by embedding silicon tube intraperitoneally. The biotube mainly included collagen-rich extracellular matrices and myofibroblasts appearing as elongated cells with circumferential or longitudinal orientations. At 1 month of embedding, the wall was 70- 250 μm in thickness and had burst strength of (1 100±187) mm Hg (1 mm Hg=0.133 kPa), with perfect sewability. The biotubes, which possess the ability for wide adjustments in their shapes, are composed of autologous cells and extracellular matrices, and are an ideal graft for tissue engineering because they avoid immunological rejection and have sufficient mechanical strength.

Key words: biomaterials, material biocompatibility, tissue-engineered vessels, autologous transplantation, biotube, autologous living tissue material, tensile strength, elongation at break, bursting strength, sweability, National 863 Program of China

中图分类号:

R318

陈晓松，张建，李建新. 一种新型活组织材料的组织学及力学特性[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(34): 6110-6115.

Chen Xiao-song, Zhang Jian, Li Jian-xin. Histological and mechanical properties of a new-type biopsy material[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(34): 6110-6115.

图/表（结果） 6

2.1 生物管制备
植入1周：硅胶管植入动物皮下及腹腔后1周时取材，见包裹组织仍较薄，部分腹腔内硅胶管包裹尚不完全，极易破碎，尚不适合用作体外材料。 植入1个月：硅胶管植入动物皮下及腹腔1个月后取材，见植入皮下及腹腔内的硅胶管均被完整包裹，皮下包裹组织与周围筋膜粘连明显，取材时容易损伤；而植入腹腔的硅胶管多数包裹于网膜组织内(25/32)，少数游离于腹腔内，有蒂与腹膜组织相连(5/32)，见图1A，B，罕有粘连于壁层腹膜(2/32)。当荚囊的一端剪开后，内部的硅胶管和包裹组织间无粘连，硅胶管很容易即可抽出。获得的活组织生物管相对厚实，质地坚韧，外表面被覆少许柔软的脂肪组织，较容易去除，管腔面较光滑，见图1C。

所得生物管在溶液中均可较好的保持开放状态，内腔直径与植入硅胶管外径接近，约为4 mm。故这次实验均以植入腹腔者1个月者为研究对象。
2.2 活组织生物管组织学检测
普通苏木精-伊红染色：对获得的活组织生物管的立埋切片进行了普通苏木精-伊红染色，光学显微镜下可见，所得生物管的管壁厚度基本均一，不同个体间或同一个体不同部位植管，所得管壁厚度略有差别，为70-250 μm，组织学显示大量胶原纤维排列成紧密板层状结构，其间可见呈同心圆状排列的梭形细胞，管壁内可见少量炎性细胞浸润，见图2。

Masson染色：新鲜自体活组织生物管经Masson染色可见胶原纤维染成蓝色，波浪状排列，呈类同心圆样结构，其间可见染为红色的平滑肌样细胞，见图3。

苦味酸天狼猩红染色：在暗视野条件下用偏振动光显微镜观察，新鲜自体活组织生物管壁显示广泛分布的绿色弱折光的Ⅲ型胶原纤维和散在分布的红黄色强折光的Ⅰ型胶原纤维，与天然血管类似，见图4。

活组织生物管的表面结构观察：扫描电镜观察可见自体活组织生物管内表面大量纤维状及膜状的细胞外基质成分，基质下隐约可见细胞胞体及纤维样突起，偶见血细胞成分，见图5。

活组织生物管肌性成分的免疫组化染色检查：免疫组化研究结果显示，管壁均含有大量的α-SMA阳性细胞，而作为成熟平滑肌细胞骨架的desmin 染色均为阴性，见图6。
2.3 活组织生物管力学检测
断裂拉伸强度和断裂伸长率的测定：为了表征活组织生物管的活组织材料的抗拉伸能力和表示材料的变形能力，实验进行了活组织生物管的断裂拉伸强度和断裂伸长率的测定。新鲜自体活组织管的断裂拉伸强度为(4.7±2.3) MPa，断裂伸长率为(34.2±8.3)%，在本组实验条件下，天然股动脉的断裂拉伸强度为(9.3±3.2) MPa，断裂伸长率为(91.5±27.1)%。
标本的爆破强度测定：为了了解自体活组织管是否具有足够的强度能够耐受生理的张力，实验进行了爆破强度检测，以了解该材料破裂前所能承受的最大压力。对8根(4组)取自不同个体的活组织生物管进行了测试，4根相应个体的天然股动脉作为阳性对照。结果显示活组织生物管的爆破强度为(1 100±187) mm Hg，远远超过正常情况下天然血管所承受的血管内压。在本组条件下，天然犬股动脉可耐受的压力为(2 280±317) mm Hg。
标本的缝合强度测定：血管组织对缝线张力的耐受性能以缝合耐受强度来界定。这里选用了6-0的丝线进行测试。每个标本测试3次，对4个不同个体的标本进行了测试。新鲜活组生物管的缝合耐受强度为(2.5±0.30) N，天然血管为(3.2±0.4) N，两者的强度接近，提示实验获得的活组织生物管具有足够的可缝合强度，能够耐受在体的端端吻合操作。

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引言

组织工程技术为开发新型血管移植材料提供了方法，但现有合成及天然材料均不能满足血管组织工程的需要。传统的血管组织工程技术以可降解的高分子材料为支架，但高分子材料存在力学性能差、难以塑形、降解产物在局部存在不同程度的毒性等缺点^[1]。因此，生物来源的材料越来越受到重视。异种或异体来源的脱细胞材料存在力学强度、顺应性上存在着特有的优势，但存在传染疾病、抗原残留等问题^[2-3]。此外，组织钙化已经成制约此来材料应用的重要原因^[4]。以胶原基架为代表的重组细胞外基质材料在生物相容性上具传统材料无法比拟的优势，然而在力学性能、顺应性等方面存在的问题极大的制约了这类材料在组织工程中的广泛应用，虽然有学者对其进行物理或化学等方法的交联及与其他材料共混等以改变其性能，但至今仍无法适用于组织工程血管的构建^{[2-3, 5]}。 Peirce和Sparks等曾尝试应用包裹现象，以埋植于皮下的异物诱导产生管形包裹组织，作为血管替代物，但均失败。由于这种移植物内腔面直接暴露着胶原纤维，后者直接促进血栓的形成，故几乎所有血管均于植入早期堵塞^[6-10]。理想的移植组织应当只包括患者自身的细胞和细胞外基质成分，且具有合适的力学特性和形状。近年来，受体自身来源的组织材料以其独具的优势，引起了人们的注意。异物诱发包裹产生的包裹组织是一种自体活组织材料，具有合成材料及脱细胞所无法比拟的生物学优势，理论上完全避免了非自体植入物所面临的免疫系统排斥反应和破坏作用，且可按需制备，从而有望解决构建组织工程血管的材料问题。但这种材料的组织学及力学特征尚无报道。实验应用了植入惰性异物诱发组织包裹的现象，首先将硅胶管植入体内而获得包裹形成的荚囊样生物组织，然后经过体外修整形成管型结构即自体活组织生物管。作为包裹形成管型组织用于小口径动脉血管前期工作，研究了其组织学成分、结构和断裂拉伸强度、断裂伸长率、爆破强度及可缝合性等力学特征。

材料方法

设计：重复测量开放性实验。

时间及地点：实验于2005年10月至2006年12月在首都医科大学宣武医院外科实验室完成(教育部重点实验室，实验室等级1级)。

材料：

实验动物：实验选用体质量为20-30 kg成年雌性杂种犬4只，由北京市科宇实验动物养殖中心提供，许可证号为SCXK 2000-0015，动物饲养级别1级。实验中对动物处置符合动物伦理学标准。

医用硅胶管：选择直径4 mm的医用中空硅胶管，分别剪裁为长度2，4，6 cm的小段，密封包装后环氧乙烷消毒灭菌，室温空气中放置1周后备用。

新型活组织材料的组织学及力学特性研究应用的主要仪器设备及试剂：

方法：

活组织生物材料获得：实验动物经肌肉注射混合麻醉后，背部、腹部备皮后，置实验动物于俯卧位，背部切口区域以2%碘伏溶液消毒3次。以手术刀作2个长度为 1 cm纵形小切口，皮下向两侧钝性分离出2个小腔，将2根长4 cm、直径4 mm的无菌医用硅胶管分别置入小腔内，丝线缝合伤口。翻转实验动物，置仰卧位，消毒铺巾后，于腹部正中作一长1.0-2.0 cm 切口，将8根无菌医用硅胶管埋植入实验动物腹腔内，分层关腹。术后1个月将腹膜或皮下组织包裹的硅胶管荚囊完整取出，于无菌条件下适当修整后，剪除封闭荚囊的两端后，抽出硅胶管后，形成管状结构。

活组织生物管组织学检测：

标本处理：分别于术后1周、术后1个月取标本，体积分数4%中性甲醛缓冲液固定48 h，乙醇逐级脱水，石蜡包埋，切成4 μm厚的薄片。

普通苏木精-伊红染色：经二甲苯脱蜡、系列乙醇脱水、苏木精-伊红染色，观察标本的大致细胞组成和排列分布，光学显微镜下测量活组织生物管的厚度。

Masson 染色：常规脱蜡至水；Masson复合染色液5 min，流水冲洗10 min，蒸馏水洗；1%磷钼酸3 min，甩干，2%的苯胺蓝溶液5 min，蒸馏水洗；1%冰乙酸溶液浸洗5 min，常规脱水透明，中性树胶封固。以犬天然股动脉血管为对照组。

苦味酸天狼猩红染色：0.1 g天狼猩红溶于100 mL苦味酸饱和液中即为苦味酸天狼猩红溶液。切片厚 5 μm，脱蜡至水，37 ℃下0.1%苦味酸天狼猩红溶液中浸染1 h，流动的自来水冲洗5 min，透明、封固。以犬天然股动脉血管为对照组。在暗视野条件下用偏振动光显微镜观察。

在偏振光下，Ⅰ型胶原纤维，紧密排列，显示很强的双折光性，呈黄色、橙色和红色的粗纤维，纤维直径越粗，红色越明显；Ⅲ型胶原纤维，疏网状，显示弱的双折光，呈绿色的细纤维；Ⅱ型胶原纤维，显示弱的双折光，呈各种不同颜色的疏松网状。

活组织生物管的表面结构观察：将获得的活组织生物管纵形剖开，内表面朝上，贴敷于干燥滤纸片上，用2.5%戊二醛和1%锇酸双重固定，乙醇逐级脱水，CO₂临界点干燥，真空喷金，扫描电镜(SEM)观察生物管内腔面的超微结构。以犬天然股动脉血管为对照组。本组实验标本均送首都医科大学附属天坛医院超微病理研究室完成。

活组织生物管肌性成分的免疫组化染色检查：为了了解生物管中肌性成分的分布情况，应用免疫组化的方法进行了抗结蛋白α-SMA和α-平滑肌肌动蛋白Desmin染色。免疫组织化学样本制备采用两步法：用中性甲醛固定标本，石蜡包埋，切成 4 μm厚的薄片，经二甲苯脱蜡、系列乙醇脱水，抗原修复，体积分数3% H₂O₂室温孵育10 min，PBS冲洗3次，滴加抗α-SMA抗体(1∶100)和抗desmin抗体(1∶100)工作液，4 ℃孵育过夜；PBS冲洗3次，滴加试剂1(Polymer helper)，室温孵育20 min，PBS冲洗后，滴加试剂2(Poly peroxidase-anti-mouse/rabbit IgG)，室温孵育30 min，PBS冲洗，显色剂显色后自来水冲洗，苏木精复染，脱水透明封固。以犬血清代替一抗作为阴性对照。

活组织生物管力学检测：

断裂拉伸强度和断裂伸长率的测定：将标本裁成板材状测试条，宽5 mm，在拉力机设定初长度为2 cm，在Shimadazu AG-5000A万能材料试验机上将其拉断。测量前标本留样行立埋冰冻切片，光学显微镜下测量材料厚度。以犬股动脉为对照组。所测的最大拉力除以实验材料的横截面积，即为标本的材料拉伸强度。记录样品从被拉伸到被拉断的长度变化，除以样品的原始长度，所的百分比即为标本材料的断裂伸长率。

标本的爆破强度测定：将活组织管标本连接于爆破压测量表，游离端封闭，装置内充盈PBS，且将标本浸入PBS中，室温下，调节加压螺栓以约50 mm Hg/s (1 mm Hg=0.133 kPa)的速度压缩腔内液体，以压力表记录管道系统内增加的压力。以天然犬股动脉为阳性对照组。爆破压被定义为管型材料破裂前所达到的最高压力，表示材料对压力变化的耐受能力。

标本的缝合强度测定：实验标本一端夹在拉力机上，另一端以6-0的尼龙缝线连接于拉力机的另一个夹具上，夹具间距离2 cm。然后以1 mm/min的速度匀速牵拉，记录完全断裂时的拉力。以犬股动脉为对照组。表示材料的可缝合性。

主要观察指标：自体活组织生物管的组织学成分、结构和断裂拉伸强度、断裂伸长率、爆破强度及可缝合性等力学特征。

讨论

实验力图开发出一种可用于体外血管组织工程的自体活组织生物材料，这种材料只含有患者自体细胞和细胞外基质成分，可用于组织工程化血管的体外构建。实验应用了具有亲水性的硅胶管作为模具，植入犬的体内，植入后1个月时即可形成包裹植入物的荚囊样结构，在体外稍加修剪即可获得所需活组织生物管，管腔内表面与植入物无粘连。作者在预实验中尝试将硅胶管种植于皮下，也可获得类似的包裹管，但由于包裹组织与皮下的筋膜组织相粘连，在获取的过程中容易损伤；而植入腹腔的包裹管多有部分游离，与周围组织境界清楚，故选用了植入腹腔的方法。获取的生物管管壁主要由富含胶原纤维的细胞外基质和成肌纤维细胞构成。胶原纤维网呈不规则近同心圆样结构，与正常血管的板层样结构类似^[11]，管壁的厚度为70-250 μm，同一根生物管的管壁厚度基本一致。与一般组织不同，用作血管组织工程的材料必须具有合适的力学特性。如必须具有足够的强度以经得起相当大的内压而不致破裂；不致因为体位变化而弯折、缠结；具有可缝合性，有临床用的可能等^[12]。胶原蛋白占人体蛋白总量的25%-33%, 广泛分布于细胞外间质, 构成组织器官的支架。胶原纤维与组织器官的生物力学特性密切相关，是血管、骨骼、软骨、肌腱、韧带等器官的基本结构物质, 使这些器官具有很高的抗张强度。组织学研究已经明确，血管的静态机械性质是靠胶原纤维等结缔组织保持的。胶原纤维分布于管壁各层，位于平滑肌细胞间及内皮下层和外膜中^[13-14]，实验构建的活组织生物管主要由胶原组织等细胞外基质构成，且以Ⅲ型胶原蛋白为主，与天然血管类似，具备与天然血管类似的同心圆状结构。力学研究证实，作者制备的天然活组织生物管具有较好的抗拉伸能力和形变能力，具有足够的爆破强度，能够耐受 1 000 mm Hg以上的腔内压力，具有类似于天然动脉类似的手术缝合性，具有很好的力学特性。有研究显示，天然动脉的胶原成分主要为Ⅰ/Ⅲ型胶原^[15]，以Ⅲ型胶原为主的胶原纤维具有较大的伸展性。胶原原纤维是构成胶原纤维的超微结构单位,而胶原原纤维的基本单位则是胶原蛋白。由于胶原蛋白a-链的螺旋方向刚好相反，胶原蛋白又是首尾相接、平行聚合，因此胶原纤维在偏振光显微镜下呈双折射现象。各型胶原蛋白形成的胶原纤维粗细不等, 在偏振光显微镜下则显示不同的颜色, 由此可对胶原蛋白的类型做出估计。天狼猩红是一种强酸性阴离子染料, 易与胶原纤维中的碱性基团起反应, 增强双折射,提高分辨率。它又是一种长形展开的分子, 与胶原分子吸附紧密, 反应稳定, 染色后不褪色且具特异性, 是目前胶原染色的最佳染料。染色后偏振光显微镜下可见Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原显示不同的颜色, 对比鲜明, 极易区别。有研究提示，天狼猩红染色与目前常用的组织特染和免疫组化两种方法相比, 操作简单、省时、花费少, 而且特异性强、灵敏度高^[16-18]。实验所构建的活组织生物管主要由Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维构成，为活组织生物管提供足够的强度。细胞外细胞外基质是由细胞合成后分泌到细胞外的一类完整的蛋白质分子，基质成分大致可归纳为糖胺聚糖与蛋白聚糖、结构蛋白，黏着蛋白三大类。近年来的研究表明，体内细胞外基质的生物学意义决不仅仅是各种细胞的支架结构和附着位点，而且对细胞的行为和基因表达调控和触发跨膜信号、细胞表型及功能转化等均起着重要的作用^[19-20]。胶原是构成血管细胞外基质的主要成分，主要位于内皮下层以及血管中层平滑肌细胞周围^[21-22]。实验构建的活组织生物管由自体活细胞和以胶原为主的天然细胞外基质成分构成，携带大量的生物信号，是构建组织工程器官的理想基架材料。结论：作者应用惰性异物诱发包裹的现象，将硅胶管植入实验动物腹腔内4周，构建了一种活组织生物管，组织学检测提示，这种活组织生物管由自体成肌纤维细胞和以Ⅰ、Ⅲ型胶原为主的细胞外基质成分构成，力学测试显示该生物管具有良好的力学强度，能够耐受大于1 000 mm Hg的爆破强度，且具有良好的缝合强度。是一种构建组织工程血管的良好基架材料。

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Histological and mechanical properties of a new-type biopsy material

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